优选在小鼠中致病力强的且分属于不同血清型的毒株，将待测菌液梯度稀释，不同稀释度乳房内注射健康易感奶牛3头，1 mL /头，攻毒后连续观测7日，记录奶牛发病情况，粗略计算最小感染量MID；以此为中心，共设3个稀释度，用PBS进行2倍比稀释，每个稀释度注射健康易感奶牛3头，1 mL /头，设置攻毒前3天至攻毒后14天为观测期记录奶牛乳房炎发病情况，确认MID。观察奶牛发病情况：(1)消瘦、体力不支、起卧困难甚至卧槽不起或腹泻甚至水样、脓样粪便；精神差甚至精神沉郁，食欲不佳甚至不食；出现心率加快合并呼吸急促的状况；(2)攻毒的乳区出现硬结等异常；乳房出现红、肿、热等炎症症状；(3)乳汁呈现水样、血样、脓样或絮状外观异常或乳汁呈现颗粒状或糊状外观异常情况；(4)日均产奶量情况；(5)不同乳区的乳汁中检出大肠杆菌情况；(6)乳汁体细胞数检测，用 DRAMINSKL MA-1体细胞计数仪检测乳汁导电率情况。