用Nanodrop测定浓缩后的磷酸化蛋白的浓度，每管取20 ng蛋白后使用超滤管将溶液置换为200mM NH₄HCO₃后，加入终浓度为1% (w/v) SDC， 100mM Tris， 5mM TCEP和30mM CAA使蛋白变性及二硫键还原和烷基化，分别采用5种加酶方式消化以增加鉴定的肽段覆盖率。管1加入胰蛋白酶 0.4 ng于37℃消化14 h；管2加入Glu-C蛋白酶 0.8 ng于37℃消化14 h；管3先加入胰蛋白酶 0.4 ng于37℃消化14 h后加入Glu-C蛋白酶 0.8 ng继续在37℃消化4 h；管4加入嗜热菌蛋白酶 0.8 ng于70℃消化14 h；管5加入1 M HCl调节pH至2.0，加入胃蛋白酶 1ng于37℃消化3h。之后加入TFA至其终浓度为0.5%以停止酶解，20000×g于室温离心10 min，保留上清，采用Oasis PRiME HLB 96孔板对其中的肽段脱盐后，在真空离心浓缩仪中干燥后保存于-80°C冰箱待液相色谱-串联质谱分析。